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禽腺病毒I群(FADV-I)PCR試劑盒常見問題及解決方案

更新日期: 2025-02-21
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禽腺病毒I群(FADV-I)PCR試劑盒常見問題及解決方案

一、檢測(cè)結(jié)果異常

1.無目標(biāo)擴(kuò)增或擴(kuò)增效率低

可能原因:

核酸提取失?。ㄈ鐦颖痉磸?fù)凍融超過5次導(dǎo)致DNA降解)  。

試劑活性下降(未按-20℃保存或反復(fù)凍融超過5次)。

PCR循環(huán)參數(shù)設(shè)置錯(cuò)誤(如退火溫度未設(shè)為60℃)。

解決方案:

優(yōu)化核酸提取步驟,推薦磁珠法或離心柱法,確保DNA純度。

檢查試劑保存條件,避免不同批次試劑混用。

核對(duì)儀器參數(shù)設(shè)置,確認(rèn)擴(kuò)增程序?yàn)椤?5℃預(yù)變性5分鐘,95℃ 15秒/60℃ 30秒,循環(huán)40次"。

2.非特異性擴(kuò)增(假陽(yáng)性)

可能原因:

樣本間交叉污染(如未使用濾芯吸頭或未區(qū)分實(shí)驗(yàn)區(qū)域)。

環(huán)境氣溶膠污染(實(shí)驗(yàn)臺(tái)未徹-底消毒)。

解決方案:

使用無菌操作技術(shù),嚴(yán)格劃分樣本處理區(qū)、試劑配制區(qū)和擴(kuò)增區(qū)。

實(shí)驗(yàn)后用10%次氯酸或75%酒精消毒操作臺(tái),廢液按生物危害物處理。

二、操作流程問題

1.樣本處理問題

常見問題:

活禽泄殖腔拭子未置于50%甘油生理鹽水中保存,導(dǎo)致核酸降解 。

組織樣本未低溫運(yùn)輸(推薦2-8℃冰袋保存),影響檢測(cè)準(zhǔn)確性。

解決方案:

嚴(yán)格按規(guī)范保存樣本,活禽拭子需浸泡于50%甘油生理鹽水,組織樣本-20℃冷凍。

2.試劑配制誤差

常見問題:

預(yù)混液未完-全溶解或混勻,導(dǎo)致反應(yīng)體系不均 。

加樣體積偏差(如未按21μL預(yù)混液+4μL樣本比例配制。

解決方案:

使用前充分溶解試劑并短暫離心,避免氣泡干擾 。

采用精準(zhǔn)移液器(如低吸附吸頭)控制加樣量。

三、儀器與數(shù)據(jù)分析問題

1.擴(kuò)增曲線異常

可能原因:

反應(yīng)管密封不嚴(yán)導(dǎo)致蒸發(fā)(曲線呈鋸齒狀或不規(guī)則)。

探針熒光衰減(未避光保存試劑或反復(fù)凍融) 。

解決方案:

檢查PCR管密封性,確保擴(kuò)增過程無液體損失。

試劑避光保存,開封后盡快使用。

2.結(jié)果判讀爭(zhēng)議

常見問題:

閾值線設(shè)置不當(dāng)(需高于陰性對(duì)照熒光信號(hào))。

可疑樣本(Ct值35.0-38.0)未復(fù)測(cè)直接判讀。

解決方案:

調(diào)整基線參數(shù)(Start值3-15,Stop值5-20),手動(dòng)設(shè)定閾值線。

對(duì)可疑樣本重復(fù)檢測(cè),若復(fù)測(cè)Ct值仍≤38.0則判為陽(yáng)性。

四、質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)與驗(yàn)證

質(zhì)控失敗處理:

陽(yáng)性對(duì)照無擴(kuò)增:檢查試劑活性或儀器校準(zhǔn)(如FAM通道是否開啟)。

陰性對(duì)照出現(xiàn)Ct值:排查環(huán)境污染或試劑污染,重新提取核酸。

五、其他注意事項(xiàng)

試劑盒適用范圍:僅限科研使用,臨床診斷需結(jié)合其他檢測(cè)方法。

冷鏈運(yùn)輸要求:試劑需-20℃保存,運(yùn)輸時(shí)使用冰袋(2-8℃)。

建議:若問題持續(xù)存在,可聯(lián)系供應(yīng)商獲取技術(shù)支持。

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