【試劑盒組份】

　　注：塑料袋內(nèi)試劑（陽性對照、RT-PCR反應(yīng)液A和B）-20℃凍存，裂解液2-8℃冷藏，其他室溫保存。

　　【熒光探針法PCR試劑盒操作方法】

　　一、樣品制備

　　1樣品采集：：病死或撲殺的禽，取肺、脾、腦等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物，放于50%甘油生理鹽水中或用注射器取血5mL，2～8℃保存。（要求送檢病料新鮮，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。）

　　2.1組織樣品的處理：稱取組織0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理鹽水繼續(xù)磨至無塊狀物；然后將樣品轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取100µL上清于1.5mL滅菌離心管中。2樣品處理：

　　2.2全血樣品的處理：待血凝后取100µL血清于1.5mL滅菌離心管中。

　　2.3陽性對照的處理：取陽性對照100µL于1.5mL滅菌離心管中。

　　2.4陰性對照的處理：取陰性對照100µL于1.5mL滅菌離心管中。

　　二、病毒RNA的提取

　　1.取已處理的樣品、陰性對照和陽性對照，分別加入450µL裂解液，充分顛倒混勻，室溫靜置3min。

　　2.加入275µL無水乙醇，輕輕混勻。

　　3.將混合液吸入吸附柱中（吸取液體時盡量不要吸到懸浮雜質(zhì)，以免離心時堵塞吸附柱），10,000rpm離心1min，棄去收集管中液體，套回收集管。

　　4.向吸附柱中加入500µL洗滌液A，10,000rpm離心1min，棄去收集管中液體，套回收集管。

　　5.向吸附柱中加入500µL洗滌液B，10,000rpm離心1min，棄去收集管中液體，套回收集管。

　　6.空柱10,000rpm離心2min。

　　7.將吸附柱移入新的無RNA酶的1.5mL離心管中，在膜中央加入30µL洗脫液，室溫靜置2min，10,000rpm離心1min，獲得總RNA。

　　三、RT-PCR

　　1.反應(yīng)體系：分別取14µLRT-PCR反應(yīng)液A（用前混勻）、4µLRT-PCR反應(yīng)液B（用前混勻）和2µL模板RNA，混勻。

　　2.反應(yīng)程序：在PCR儀上運行以下程序：42℃45min，94℃3min；94℃30s、53℃30s、72℃30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。

　　四、電泳

　　1.制膠：用50倍稀釋的TAE電泳緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠。

　　2.電泳：待膠凝固后，取5µLPCR擴增產(chǎn)物點樣于瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm的電壓于50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳。

　　3.染色：取50倍稀釋的TAE電泳緩沖液30mL，加入10µL染色液，混勻后將膠浸泡30min，于紫外燈下觀察結(jié)果。

　　【結(jié)果判斷】

　　陽性對照出現(xiàn)400bp擴增帶，陰性對照無帶出現(xiàn)（引物帶除外）時，實驗結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)400bp擴增帶為新城疫病毒陽性，否則為陰性。

　　【需用但未提供的材料】

　　組織研磨器、眼科剪、眼科鑷、一次性注射器、瓊脂糖、經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）處理的滅菌1.5mL離心管和吸頭（10µL、200µL、1000µL）。

　　【注意事項】

　　1．本試劑盒有效期為6個月，不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的組分不要混用。

　　2．所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲存，使用時拿到室溫下，使用后立即放回。

　　3．注意防止試劑盒組分受污染。使用前將塑料袋內(nèi)試劑瞬離15s，使液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取。

　　4．嚴(yán)格按試劑盒說明書操作可以獲得的結(jié)果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。

　　5．RNA提取過程中，應(yīng)戴口罩、勤換手套，盡量縮短操作時間。

　　6．所有接觸病料的物品均應(yīng)合理處理，以免污染實驗室。