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產(chǎn)品名稱:

熒光探針法PCR試劑盒

產(chǎn)品型號: 產(chǎn)品時間: 2023-07-05
熒光探針法PCR試劑盒有效期為6個月,不要使用超過有效期限的試劑,試劑盒之間的組分不要混用,適用于AIV的檢測、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

產(chǎn)品概述

  熒光探針法PCR試劑盒說明書:
  
  【試劑盒簡介】
  
  熒光探針法PCR試劑盒采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測禽組織、分泌物和排泄物中所有亞型的AIV,適用于AIV的檢測、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。
  
  【原理】
  
  利用吸附柱提取RNA作為模板,在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下,以引物為起點合成與RNA模板互補的cDNA鏈;然后在DNA聚合酶的作用下,經(jīng)高溫變性、低溫退火和中溫延伸的多次循環(huán),使特異DNA片段的拷貝數(shù)放大數(shù)百萬倍。將擴增的DNA片段進(jìn)行電泳、染色后,在紫外燈下,肉眼可見DNA片段的擴增帶。
  
  大腸菌O157檢測試劑盒(玻片乳膠凝集反應(yīng)法)
  
  大腸埃希氏菌血清
  
  志賀氏菌診斷血清
  
  無菌脫纖維馬血
  
  無菌脫纖維兔血
  
  

【試劑盒組份】

1. 生理鹽水

20mL

8. 吸附柱和收集管

10套

2. 裂解液

6mL

9. 0.2 mL 薄壁PCR 管

15個

3. 洗滌液A

7mL

10. RT-PCR 反應(yīng)液A

180μL

4. 洗滌液B

7mL

11. RT-PCR 反應(yīng)液B

50μL

5. 洗脫液

500μL

12. 50 倍TAE 電泳緩沖液

20mL

6. 陰性對照

300μL

13. 染色液

10μL

7. 陽性對照

300μL

 

 

  注:塑料袋內(nèi)試劑(陽性對照、RT-PCR反應(yīng)液A和B)-20℃凍存,裂解液2-8℃冷藏,其他室溫保存。

  

  【熒光探針法PCR試劑盒操作方法】

  

  一、樣品制備

  

  1樣品采集::病死或撲殺的禽,取肺、脾、腦等組織;待檢活禽,用棉拭子取呼吸道分泌物,放于50%甘油生理鹽水中或用注射器取血5mL,2~8℃保存。(要求送檢病料新鮮,嚴(yán)禁反復(fù)凍融。)

  

  2.1組織樣品的處理:稱取組織0.1g于研磨器中磨碎,再加1mL生理鹽水繼續(xù)磨至無塊狀物;然后將樣品轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中,8000rpm離心2min,取100µL上清于1.5mL滅菌離心管中。2樣品處理:

  

  2.2全血樣品的處理:待血凝后取100µL血清于1.5mL滅菌離心管中。

  

  2.3陽性對照的處理:取陽性對照100µL于1.5mL滅菌離心管中。

  

  2.4陰性對照的處理:取陰性對照100µL于1.5mL滅菌離心管中。

  

  二、病毒RNA的提取

  

  1.取已處理的樣品、陰性對照和陽性對照,分別加入450µL裂解液,充分顛倒混勻,室溫靜置3min。

  

  2.加入275µL無水乙醇,輕輕混勻。

  

  3.將混合液吸入吸附柱中(吸取液體時盡量不要吸到懸浮雜質(zhì),以免離心時堵塞吸附柱),10,000rpm離心1min,棄去收集管中液體,套回收集管。

  

  4.向吸附柱中加入500µL洗滌液A,10,000rpm離心1min,棄去收集管中液體,套回收集管。

  

  5.向吸附柱中加入500µL洗滌液B,10,000rpm離心1min,棄去收集管中液體,套回收集管。

  

  6.空柱10,000rpm離心2min。

  

  7.將吸附柱移入新的無RNA酶的1.5mL離心管中,在膜中央加入30µL洗脫液,室溫靜置2min,10,000rpm離心1min,獲得總RNA。

  

  三、RT-PCR

  

  1.反應(yīng)體系:分別取14µLRT-PCR反應(yīng)液A(用前混勻)、4µLRT-PCR反應(yīng)液B(用前混勻)和2µL模板RNA,混勻。

  

  2.反應(yīng)程序:在PCR儀上運行以下程序:42℃45min,94℃3min;94℃30s、53℃30s、72℃30s,35個循環(huán);72℃延伸10min。

  

  四、電泳

  

  1.制膠:用50倍稀釋的TAE電泳緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠。

  

  2.電泳:待膠凝固后,取5µLPCR擴增產(chǎn)物點樣于瓊脂糖凝膠孔中,以5V/cm的電壓于50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳。

  

  3.染色:取50倍稀釋的TAE電泳緩沖液30mL,加入10µL染色液,混勻后將膠浸泡30min,于紫外燈下觀察結(jié)果。

  

  【結(jié)果判斷】

  

  陽性對照出現(xiàn)400bp擴增帶,陰性對照無帶出現(xiàn)(引物帶除外)時,實驗結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)400bp擴增帶為新城疫病毒陽性,否則為陰性。

  

  【需用但未提供的材料】

  

  組織研磨器、眼科剪、眼科鑷、一次性注射器、瓊脂糖、經(jīng)焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的滅菌1.5mL離心管和吸頭(10µL、200µL、1000µL)。

  

  【注意事項】

  

  1.本試劑盒有效期為6個月,不要使用超過有效期限的試劑,試劑盒之間的組分不要混用。

  

  2.所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲存,使用時拿到室溫下,使用后立即放回。

  

  3.注意防止試劑盒組分受污染。使用前將塑料袋內(nèi)試劑瞬離15s,使液體全部沉于管底,放于冰盒中,吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取。

  

  4.嚴(yán)格按試劑盒說明書操作可以獲得的結(jié)果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。

  

  5.RNA提取過程中,應(yīng)戴口罩、勤換手套,盡量縮短操作時間。

  

  6.所有接觸病料的物品均應(yīng)合理處理,以免污染實驗室。

 

 

  

 

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